石金钱龟提取物增强小鼠免疫力作用及其主要活性成分分析

      摘要：本实验以七年生石金钱龟为研究材料，采用醇提、水提法分别获得龟甲、龟肉提取物，将龟肉提取物和龟甲提取物以2:1的比例混合制得石金钱龟提取物，采用常规的食品成分分析方法对其主要营养素含量进行测定，利用环磷酰胺建立小鼠免疫低下模型，较为系统地研究石金钱龟提取物增强小鼠免疫力的保健功能。实验小鼠分为空白组、环磷酰胺模型组、石金钱龟提取物低剂量组(250 mg/kg)、石金钱龟高剂量组(500 mg/kg)，通过测其胸腺指数、脾脏指数，以及用碳粒廓清实验来评价吞噬指数和吞噬系数。试验结果表明低、高剂量的石金钱龟提取物均具有良好的增强小鼠免疫功能的作用，且高剂量组的作用效果更好。石金钱龟提取物中的主要活性成分用常规方法进行了测定分析，结果如下：粗蛋白(56.97±1.01 g/100g)、粗脂肪(25.87±1.45 g/100g)、胆固醇(312.91±5.79 mg/100g)、氨基酸(53.60±2.39 mg/100g)、水分(0.629±0.043 g/100g)；同时对提取物进行酶解，以水解度(DH)为评价指标，在单酶酶解实验中，选用风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶为水解酶。结果表明碱性蛋白酶的水解度最高，故选择碱性蛋白酶为最佳酶，并在此基础上进行酶解工艺的研究，通过正交试验获得最佳的酶解工艺pH值为7.5，水解温度为55℃，加酶量为3.5%，料液比为1∶25 (g:ml)，其水解度可达38.45%，各因素对水解度的影响顺序为：pH值＞料液比＞酶解温度＞酶用量。本实验的研究结果可为将石金钱龟提取物开发成一种新型保健食品或者原料打下前期基础。

     关键词：石金钱龟；环磷酰胺；免疫低下；增强免疫力；活性成分；酶解

1 前言

      免疫是指机体接触“抗原性异物”或“异己成分”产生的一种特异性生理反应，它是机体在进化过程中所获得的“识别自身、排斥异己”的一种重要生理功能。免疫系统对维持机体正常生理功能具有重要意义。免疫功能低下，会对机体健康产生极为不利的影响，提高多种传染病、非传染病的发病率和死亡率，其中引人关注的有恶性癌症、糖尿病等。造成机体免疫下降的原因有多种，诸如年龄增大、营养失衡、慢性疾病、药物、应激、精神或心理因素、内分泌失调和遗传因素等。

      免疫调节药物或功能食品主要用于机体免疫功能障碍的疾病，如可增强由于肿瘤、衰老、慢性病毒感染（肝炎、艾滋病等）造成的免疫功能低下，或抑制器官移植后排斥反应及自身免疫性疾病时某些不正常的免疫反应。

      环磷酰胺从上世纪50年代后就被作为一种广谱和具有高疗效的烷化剂用于临床抗癌中(Pass et al., 2005)。然而，环磷酰胺除了对癌细胞有作用外，对正常细胞也会有杀伤作用。其所具有的诱导白细胞减少和免疫低下作用是限制其作为临床药物的原因(Rood et al., 2004; Rossi et al., 2008; Wang et al., 2012)。为了增强临床药物的功效活性并且减少其毒性，已有研究报道将一些具有活性功能的中草药等与环磷酰胺混合使用，如草决明(Bin et al., 2001)、苦味叶下珠(Bin et al., 2001)、穿心莲(Sheeja and Kuttan, 2006)等。

      龟类动物是一群身覆甲壳的现存最古老的爬行动物，在社会经济活动中，龟类动物的利用价值已逐步被人类所认识，并且通过食用、药用、文化及观赏等方面直接或间接地体现出来（周婷，2007）。在我国养龟业中，乌龟、红耳彩龟、大鳄龟、黄喉拟水龟、黄缘盒龟、蛇鳄龟、中国三线闭壳龟、越南三线闭壳龟和中华花龟 9 种龟类动物是主要的养殖对象（周婷和李丕鹏，2007）。

      石金钱龟，学名黄喉拟水龟(Mauremys mutica Cantor)，两广俗称石龟，分类上隶属龟鳖目、龟科、拟水龟属。国内主要分布于江浙、安徽、两广、海南、福建及台湾，国外分布于越南。石金钱龟是一种食药兼用的龟类，具有观赏价值及较高的营养价值和多种医疗保健功能（周维官等，2007），民间有可治疗癌症之说，其增强免疫力和抗肿瘤功效备受人们关注，中国古代书籍如“神农本草”、“山海经”和“本草纲目”都有关于龟类作为药材的记载。石金钱龟的最大价值是药用。龟体中含有较多的特殊长寿因子和免疫活动物质，常食可增强人体免疫力，使人长寿。石金钱龟较其它类型的龟具有更高的食用和应用价值，因此成为在亚洲交易最普遍的海龟( Hendrie, 2000; Lau and Shi, 2000; Shi and Pharham, 2001）。石金钱龟的最大价值是药用。龟体中含有较多的特殊长寿因子和免疫活动物质，常食可增强人体免疫力，使人长寿。龟肉味甘、咸平、性温，有强肾补心壮阳之功，龟肉与提高人体免疫力有关系；主治痨瘵骨蒸、久咳咯血、血痢、筋骨疼痛、病后阴虚血弱，尤其对小儿虚弱和产后体虚、脱肛、子宫下垂及性功能低下等有较好的疗效，龟甲气腥、味咸、性寒，其主要成分为骨胶原、蛋白质、脂肪、钙、磷、肽类和多种酶以及多种人体必需微量元素。具有滋阴降火、潜阳退蒸、补肾健骨、养血补心等多种功效，龟甲对肿瘤也有一定的作用。石金钱龟所具有的药效作用可能与其所含的蛋白质、氨基酸以及蛋白质的水解物多肽等有关。

      生物活性肽（Biological active peptide）是指具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肽（张岩等，2012）。酶解法是一种新兴的动物蛋白水解液的生产方法。与已有的生产方法相比，酶解法有很多优点，因此对酶法生产动物蛋白水解液的研究很受重视（宋焕禄和廖国洪，2001）。蛋白质的水解度DH（Degree of hydrolysis）代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，数学表达式为：；式中：h是被裂解的肽键数，htot是原蛋白质中的总肽键数，这里的h和htot单位经常用mmol/g表示(蒋婧，2011），对于一个特定的蛋白质，htot是一个常数，一般采用文献中的经验值，比如：大豆蛋白质的htot 值为7.8 mmol/g，酪蛋白质的htot值为8.2 mmol/g(杨文博和张英华，2014)，在水解过程中，当肽键断裂后，就会有一个新的- COOH 和- NH2 形成，因此，水解肽键的数，就可以根据水解后测定新形成的末端- COOH 或- NH2 基团的量确定（徐英操和刘春红，2007）。以水解度为指标来评价酶解程度，确定最适酶解条件。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 材料来源

     七年生石金钱龟：由广东省东莞龟协会江仰焰副会长提供。

     实验小鼠：昆明小鼠，雌雄各半，18 g-22 g，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心（实验动物合格证号：SCXK 2008-0005）。

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要设备

2.2 石金钱龟提取物的制备

      将七年生黄喉拟水龟在热水中处死，分别取其龟甲和龟肉。将肉切成小块，洗去血污，于冰箱中冷藏，贴标签；将龟甲掰成小块洗净，每个烧杯中加入5% 醋酸浸没龟甲，贴好标签，常温封存，浸泡2 d，隔天换醋酸。

      龟肉的提取：将龟肉冷藏样常温自然回温，置于蒸煮锅内熬制2 h，至汤汁呈白色（微黄）浓稠；将汤汁趁热抽滤，得滤液入500 ml圆底烧瓶旋蒸浓缩，旋蒸温度

55 ℃，至基本无冷凝液滴下，将浓缩物倒入250 ml塑料杯中，保鲜膜封口置于4 ℃冷藏；抽滤后的残渣继续加蒸馏水煮制，熬2 h至汤汁浓稠，再次抽滤，将浓缩液与第1次浓缩液混合；抽滤后的残渣第3次熬制1.5 h至汤汁较浓；再次抽滤，将浓缩液与前2次浓缩液混合，将3次所得浓缩液再次旋蒸浓缩，得总提取物，并盛于塑料烧杯中冻存，提取物冻成块状凝胶后称重。

      龟甲的提取：将龟甲掰碎，洗净置于1000 ml圆底烧瓶，加入500 ml 50% 乙醇，接冷凝管回流煮制2.5 h；第1次煮出液趁热抽滤，滤液分次入500 ml圆底烧瓶内旋蒸，滤渣留1000 ml圆底烧瓶供第2次醇煮；旋蒸2 h得第一次浓缩液，向1000 ml烧瓶中加入500 ml 80%乙醇，接冷凝管煮2 h；第2次煮出液抽滤旋蒸得第2次浓缩液，滤渣入锥形瓶中贴标签放入冰箱冷藏；将2次浓缩液合并再次旋蒸至基本无挥发物，得龟甲提取物，入塑料烧杯冷冻，冻成凝胶后称重。

      样品的冻干：将提取物冷冻样分量装于小塑料烧杯内，厚度控制在3 cm左右，用保鲜膜封口，皮筋扎紧，用小枪头在薄膜上打孔若干，放入冻干机冻干48 h，转入冰箱冷冻保存。

     石金钱龟提取物制备：将冻干后的龟甲与龟肉按照1:2的比例混合即得。

2.3 石金钱龟提取物的免疫作用评价

2.3.1 石金钱龟提取物对正常小鼠体重及免疫器官指数的影响试验方法

     昆明小鼠，雌雄各半，18 g - 22 g，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心饲养条件：雌雄分开喂养，温度24±2℃，湿度50% - 70%，每天添加饲料2次，换水1次，每2 d更换1次垫料，动物自由进食、饮水。将30只昆明小鼠随机分为正常对照组（给予等体积生理水）、石金钱龟提取物低剂量组（250 mg/kg）、高剂量组（500 mg/kg），每组10只。各组小鼠均采取连续灌胃10 d，按以上剂量灌胃给药（0.2 ml/10g），每天1次。小鼠体重每天称量1次。末次给药前12 h禁食不禁水，于末次给药1 h后，脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏精密称取湿重，按照如下公式计算脏器系数。

2.3.2  石金钱龟提取物对免疫低下小鼠体重及免疫器官指数的影响试验方法

     昆明小鼠，雌雄各半，18 g - 22 g，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心。饲养条件：雌雄分开喂养，温度24±2℃，湿度50% - 70%，每天添加饲料2次，换水1次，每2 d更换1次垫料，动物自由进食、饮水。将40只昆明小鼠随机分为正常对照组（给予等体积生理水）、模型组（给予等体积生理水并腹腔注射环磷酰胺）、石金钱龟提取物低剂量组（250 mg/kg）、高剂量组（500 mg/kg），每组10只。小鼠分组后先灌胃给药3 d，第4 d开始除正常对照组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺80 mg/kg，连续3 d制造免疫功能低下小鼠模型，造模期间各组均采取上述给药方式给药，造模后再给药4 d。小鼠体重每天称量1次。末次给药前12 h禁食不禁水，于末次给药1 h后，脱颈椎处死小鼠，取胸腺和脾脏精密称取湿重，按照如下公式计算脏器系数（宋雁等，2013；齐丽娟等，2010；王颖等，2004）。

2.3.3 对腹腔单核-巨噬细胞吞噬功能的测定

      昆明小鼠，18 g - 22 g，雌雄各半，购于湖北省疾病预防控制中心实验动物中心饲养条件：雌雄分开喂养，温度24±2℃，湿度50% - 70%，每天添加饲料2次，换水1次，每2 d更换1次垫料，动物自由进食、饮水。将40 只昆明小鼠随机分为正常对照组（给予等体积生理水）、模型组（给予等体积生理水并腹腔注射CY）、石金钱龟提取物低剂量组（250 mg/kg）、高剂量组（500 mg/kg），每组 10 只。按以上剂量灌胃给药（0.2 ml/10g），每天1次，连续10 d。给药第4 d除正常对照组外，其余各组注射环磷酰胺80 mg/kg/d，连续3 d，造成免疫功能抑制模型。提前12 h禁食不禁水，于末次给药1 h后，分别称重，从尾静脉注入墨汁稀释液，立即计时。分别在注入墨汁后 1 min（t1）和 6 min（t2），用经肝素处理的定量毛细管由小鼠眼眶后静脉丛取血 25 µL，并立即加入到 0.1% Na2CO3溶液 3 ml 中，用毛细管吹打均匀，混匀后于675 nm 处测定吸光度，以 Na2CO3溶液作为空白对照。脱臼处死小鼠取肝、胸腺和脾称重，计算脏器指数，以吞噬指数表示小鼠碳廓清能力（胡彦武，2011；王红梅等，2003）。

      碳粒廓清率K=（lgA1-lgA2）/（t2-t1）

      吞噬指数 α=K1/3×体重/(肝重+脾重)

2.4 龟肉中营养成分评价

2.4.1水分含量的测定

2.4.1.1原理

      利用红外高温照射，使龟甲、龟肉中的水分蒸发，从而得知样品中的水分含量。

2.4.1.2 实验步骤

a.打开水分快速测定仪

b.将称量纸剪成快速水分测定仪中称量盘大小，放在其上调零

c.将大于0.5 g的样品放在称量纸上，并记录质量

d.盖上盖子，让其自动蒸发，完成后记录仪器上显示的数据，即为水分含量。

2.4.2 胆固醇含量的测定

2.4.2.1 原理

      当固醇类化合物与酸作用时，可脱水并发生聚合反应，产生颜色物质，因此可先对食品样品进行提取和皂化，用磷硫铁试剂作为显色剂，测定食品中胆固醇的含量。在样品的冰乙酸提取液中加磷硫铁试剂，胆固醇与试剂反应产生紫红色化合物，颜色的深浅与胆固醇的量成正比，可用分光光度计在波长560 nm处测定（张佳程等，1999）。

2.4.2.2 实验步骤

a. 样品胆固醇提取：准确称取干燥的石金钱龟提取物0.2000 g于25 ml具塞比色管中，加入0.5 ml 50%氢氧化钾溶液和4.5 ml无水乙醇，振荡混匀，在80 ℃恒温水浴中皂化20 min。皂化时每5 min振摇一次使皂化完全。皂化完毕，取出比色管，冷却。加入10 ml石油醚（30 - 60℃沸程），盖紧玻璃塞，振摇1 min，静置分层。取上层石油醚液1 ml，置于25 ml具塞比色管内，在65 ℃水浴中让石油醚自然挥发干，加入4 ml冰乙酸，轻摇使胆固醇溶解，待测。（样品A）

b. 样品和标准胆固醇含量测定：另取两支25 ml具塞比色管，一支加入4 ml冰乙酸（空白B），一支加入1 ml胆固醇标准溶液（0.1 mg/ml）和3 ml冰乙酸（标样C）。A、B、C三管，各管分别加入2 ml磷硫铁试剂，混匀，25 ℃放置20 min后在560 nm波长下比色。以空白管调零，测得吸光度。

c. 计算：胆固醇含量

2.4.3 氨基酸含量的测定

2.4.3.1 原理

     氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物（脯氨酸除外），最大吸收波长在570 nm处，在一定的浓度范围内，有色物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可在570 nm处用分光光度法测定；以甘氨酸为标样，绘制标准曲线。

2.4.3.2 实验步骤

a. 标准曲线的绘制

     准确吸取200 µg/ml的氨基酸标准溶液0.0、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 ml，分别置于10 ml比色管（或容量瓶）中，各加入蒸馏水至体积为1.6 ml，然后加入磷酸缓冲液和茚三酮溶液各0.4 ml，混匀，置于沸水浴中加热15 min，取出后迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15 min后，于570 nm波长下，以试剂空白为参比测定标准系列溶液的吸光度值A，以氨基酸的微克数为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线。

b. 样品的测定

     取石金钱龟提取物0.1000 g，加蒸馏水溶解，定容到100 ml，浓度为1000 µg/ml，吸取澄清的石金钱龟提取物溶液2 ml置于25 ml比色管中，按测定标准曲线的步骤进行实验，冷却至室温后加水到12.5 ml，在相同条件下测定样品的吸光度Ax，并在标准曲线上查出其氨基酸含量微克数；平行测定三份。

c. 结果计算

2.4.4 脂肪含量的测定

2.4.4.1 原理

     脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物，能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂（乙醚或石油醚）将脂肪提取出来，蒸发除去溶剂后称量。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及脂溶性色素等，故称为“粗脂肪”(GB/T 5009.6-2003)。

2.4.4.2 实验步骤

     准确称取2 g左右干燥并磨碎了的龟肉样品，于已恒重的滤纸上，包好并用脱脂线绳扎好，并称重，记为W0。筒高低于虹吸管。在提取瓶内注入无水乙醚约至瓶体积2/3，于50oC水浴加热。乙醚开始回流以后，调节温度，使虹吸回流速度控制在8 - 12次/小时，抽提2 h - 3 h。将滤纸包取出，于通风厨内，用电吹风吹干，然后移入干燥缸内冷却后称重W1，计算含油量。

2.4.4.3 计算

2.4.5 蛋白质含量的测定

2.4.5.1原理

     食品及其原料中蛋白质含量的高低是其质量的一个重要指标。微量凯氏定氮法是测定蛋白质最常用的方法，其原理是将样品与硫酸共同加热消煮，使蛋白质分解，其中的氮氧化成氨，氨与硫酸化合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨逸出，冷凝并用硼酸吸收，生成四硼酸铵盐，以标准盐酸滴定。食品蛋白质中氮含量通常在16%左右，氮含量乘以换算系数6.25（100/16）可得粗蛋白含量。之所以称为粗蛋白是因为凯氏定氮法所测得的总氮量中，除蛋白质氮外，还包括氨基酸、酰胺、核酸中的氮的缘故(GB 5009.5-2010)。

2.4.5.2 实验步骤

a. 消化：准确称取龟肉样品0.5 g左右，置100 ml凯氏烧瓶中，加入6 g硫酸钾、0.2 g硫酸铜，及20 ml浓硫酸（比重1.84），摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5 h - 1 h。取下放冷，小心加入20 ml水。放冷后，移入100 ml 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。备用；同样条件下消化一份空白。

b. 蒸馏：于50 ml三角瓶中加入2%硼酸溶液10 ml，并加入3滴溴甲酚绿—甲基红混合指示剂，置于凯氏蒸馏装置的冷凝管下端处，使管口浸入硼酸溶液内，开冷凝水，并使体系各处密闭。吸取10 ml 试样处理液由小玻杯注入反应室，再加入10 ml 40% 氢氧化钠溶液于小漏斗中，缓缓放入，并始终保持液封，用少许蒸馏水洗涤漏斗，保持液封。然后开始加热蒸馏，待三角瓶接收液的颜色变为绿色时，再蒸馏5 min，此时氨已全部进入硼酸溶液。停止加热前应先使接收液面离开冷凝管管口，放在冷凝管下方，利用冷凝液洗涤冷凝管内壁，并用少许蒸馏水冲洗管口下端。将三角瓶移开蒸馏设备，准备滴定。

c. 滴定：于上述硼酸接收液中加入3滴溴甲酚绿—甲基红指示剂，用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色后，再加1滴盐酸溶液使呈红色为止。同样步骤进行空白实验，按下列公式，计算出样品中的粗蛋白质含量。

2.4.5.3 计算

2.5 几种蛋白酶酶活力的测定

2.5.1 实验原理

      福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660 nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。本实验参照(SB/T 10317-1999)。

2.5.2 实验步骤

a. 标准曲线的制作

     按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液。

表1 不同浓度的酪氨酸溶液的配制

Table 1 Preparing for different concentrations of tyrosine

      取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1 ml，各加入0.4 mo1碳酸钠5 ml,再各加人已稀释的福林试剂1 ml。摇匀置于水浴锅中。40 ℃下保温发色20 min，在660 nm下测其吸光度。测三次，取平均值。将1-6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。

b. 酶活力测定

     取10 ml试管3支，编号1，2，3，每管内加入样品稀释液(风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶）1 ml，置于40 ℃水浴中预热2 min，再各加入经同样预热的酪蛋白1 ml，精确保温10 min，时间到后，立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 ml终止反应，继续置于水浴中保温20 min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取10 ml试管3支，编号 l，2，3，每管内加入滤液1 ml，再加0.4 mol碳酸钠5 ml，已稀释的福林试剂1 ml摇匀，40 ℃保温发色20 min后测定其吸光度（OD值）。

2.5.3 计算

2.6 酶解单因素条件的探究

2.6.1 最佳用酶的选择

      选择风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，控制三者酶活力均为6000 U/g，风味蛋白酶在其最佳温度50 ℃和最适pH 7.0，复合蛋白酶在其最佳温度50℃和最适pH 6.5，碱性蛋白酶最佳温度55℃，pH 7.5的条件下酶解，每隔30 min取1 ml 酶解液然后用沸水浴灭酶10 min，10000 r/min 离心10 min后取上清测定其中的氨基酸含量，计算水解度。选择在同等酶活条件下对蛋白质水解度高的酶作为后续实验用酶。

2.6.2 酶解时间的确定

      选择碱性蛋白酶为水解用酶，称取1 g左右样品，加入30 ml pH为7.5的PBS缓冲溶液，3%的碱性蛋白酶，在55℃下恒温磁力搅拌酶解。每隔30 min取1 ml酶解液于1.5 ml离心管中，灭酶后于10000 r/min离心10 min后取上清液，待用。用茚三酮反应测定不同酶解时间的酶解液中氨基酸的含量。

2.6.3 酶解料液比的确定

      选择碱性蛋白酶为水解用酶，称取1 g左右样品，分别加入20 ml、30 ml、40 ml pH为7.5的PBS缓冲溶液，使料液比分别为1:20、1:30、1:40，各加入3%的碱性蛋白酶，在55℃下恒温磁力搅拌酶解。酶解6 h后，将酶解液灭酶、离心后取上清液，待用。用茚三酮反应测定不同料液比条件下酶解液中的氨基酸含量。

2.6.4 酶解酶量的确定

      选择碱性蛋白酶为水解用酶，称取1 g左右样品，各加入30 ml pH为7.5的PBS缓冲溶液，分别加入1%、2%、3%、4%的酶量，在55 ℃下恒温磁力搅拌酶解。酶解6 h后，将酶解液灭酶、离心后取上清液，待用。用茚三酮反应测定不同酶量条件下酶解液中的氨基酸含量。

2.6.5 酶解pH值的确定

      选择碱性蛋白酶为水解用酶，称取1 g左右样品，分别加入30 ml pH为7、7.5、8的PBS缓冲溶液，各加入3%的酶量，在55 ℃下恒温磁力搅拌酶解。酶解6 h后，将酶解液灭酶、离心后取上清液，待用。用茚三酮反应测定不同pH条件下酶解液中的氨基酸含量。

2.6.6 酶解温度的确定

      选择碱性蛋白酶为水解用酶，称取1 g左右样品，加入30 ml pH为7.5的PBS缓冲溶液，加入3%的酶量,分别在50℃、55℃、60 ℃下恒温磁力搅拌酶解。酶解6 h后，将酶解液灭酶、离心后取上清液，待用。用茚三酮反应测定不同酶解温度条件下酶解液中的氨基酸含量。

2.7 正交试验进一步优化酶解条件

     根据单因素试验结果，为了得到较准确的工艺条件及参数，对加酶量、酶解温度、pH、料液比4个主要因素，以水解度为指标，采用L９（3４）正交设计进行实验，对酶解石金钱龟提取物的条件进行了优化（纪莹等，2012）。

2.8 水解度的测定

     用茚三酮法测不同条件下酶解液中的氨基酸含量，以此来评价不同酶解条件下的水解度大小。

2.8.1 实验原理

     龟肉中的蛋白质在酶解条件下可以被水解成小分子肽和氨基酸，氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物（脯氨酸除外），最大吸收波长在570 nm处，在一定的浓度范围内，有色物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可在570 nm处用分光光度法测定，因此可采用茚三酮法测定酶解后样品溶液中氨基酸的含量，从而确定蛋白质的水解度。

2.8.2 实验步骤

a. 标准曲线的制作

      准确吸取200 µg/ml的氨基酸标准溶液0.0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml，分别置于10 ml比色管（或容量瓶）中，各加入蒸馏水至体积为1.6 ml，然后加入磷酸缓冲液和茚三酮溶液各0.4 ml，混匀，置于沸水浴中加热15 min，取出后迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置15 min后，于570 nm波长下，以试剂空白为参比测定标准系列溶液的吸光度值A，以氨基酸的微克数为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线。

b. 样品测定

      取酶解后的样品溶液25 μl置于10 ml比色管中，按测定标准曲线的步骤进行实验，冷却至室温后加水到10 ml，在相同条件下测定样品的吸光度A，并在标准曲线上查出其氨基酸含量微克数；平行测定三份。

3结果与分析

3.1 石金钱龟提取物对正常小鼠体重及免疫器官的影响

图1 石钱龟提取物对正常小鼠体重的影响（±S）(n=10)

Fig.1 The effect of YPT extract on body weight of normal mice without CY inducement

表2. 石钱龟提取物对正常小鼠免疫器官指数的影响（±S）(n=10)

Table 2. The influence of YPT extract on immune organs indices in normal mice without CY inducement（±S） (n=10)

与空白组比较，* 表示P < 0.05

     由图1和表2可以看出，石金钱龟提取物对正常小鼠的体重和胸腺、脾脏等免疫器官指数均没有显著性影响。

3.2 石金钱龟提取物对免疫低下小鼠体重和免疫器官的影响

图2 石金钱龟提取物对环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠体重的影响

Fig.2 The effect of YPT extract on body weight of CY treatment mice

表3. 石钱龟提取物对免疫低下小鼠免疫器官指数的影响（±S）(n=10)

Table 3. The influence of YPT extract on immune organs indices in CY-induced mice（±S） (n=10)

与模型组比较，* 表示P < 0.05，** 表示P < 0.01

     由图2可以看出，在没有使用环磷酰胺时的前3 d小鼠体重有明显增重现象，从第4 d开始对小鼠进行腹腔注射环磷酰胺，连续给药3 d，从第4 d开始，除空白组外，其余小鼠体重开始有明显下降。石金钱龟各给药组相比于模型组，小鼠体重有显著性增加，说明石金钱龟提取物对小鼠的免疫损伤起到恢复作用。高剂量组的小鼠体重一直高于低剂量，说明高剂量组的免疫效果比低剂量组的免疫效果要好。

     由表3可以看出，与正常空白组比较，模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数均大大下降，其差异有统计学意义(P < 0.01)，说明造模成功；与模型组相比，石金钱龟提取物低剂量、高剂量组可极显著性增加免疫低下小鼠的脾脏指数(P < 0.01)，同时石金钱龟提取物低剂量、高剂量组均可极显著增加免疫低下小鼠的胸腺指数(P < 0.01)。

3.3 石金钱龟提取物对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞系统碳粒廓清功能的影响

表4. 石钱龟提取物对免疫低下小鼠单核-巨噬细胞系统碳粒廓清功能的影响

（±S）(n=10)

Table 4. The influence of YPT extract on monocyte-macrophages in CY-induced mice（±S） (n=10).

与模型组比较，* 表示P < 0.05，** 表示P < 0.01

     由表4可以看出，与正常空白组比较，模型组小鼠吞噬指数、吞噬系数均大大下降，其差异有统计学意义(P < 0.01)，说明造模成功；与模型组相比，石金钱龟提取物低剂量可显著性增加免疫低下小鼠的吞噬指数和吞噬系数(P < 0.05)，同时石金钱龟提取物高剂量组均可极显著增加免疫低下小鼠的吞噬指数和吞噬系数(P < 0.01)。

3.4 石金钱龟提取物中的各种营养成分含量

     通过材料与方法中所述的测定方法，测定出的各物质含量如表5所示。

表5. 石金钱龟提取物龟肉中各活性成分含量（±S）(n=3)

Table 5. The main active contents of the YPT extract（±S）(n=3)

3.5 最佳用酶的选择

     碱性蛋白酶和复合蛋白酶对小黄鱼蛋白酶解的水解度均比较高，但以碱性蛋白酶为最高，而风味蛋白酶的水解度明显很低（见图3）。考虑到经济效应，因此，选取碱性蛋白酶为最佳酶解用酶，并以此酶进行后续实验，进一步研究其最佳酶解工艺。

图3 不同蛋白酶酶解龟肉蛋白的水解度

Fig.3 Effect of protease type on the hydrolysis of yellow pond turtle protein

      由图3中可以看出，在风味蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶各自最适的温度和pH值下，以相同的酶活力酶解相同的时间，碱性蛋白酶得到的水解度最高，因此后续实验选用碱性蛋白酶来酶解石金钱龟提取物，以得到最佳酶解条件。

3.6 酶解时间对水解度的影响

图4 酶解时间对水解度的影响

Fig.4 Effect of enzymatic time on the hydrolsis of yellow pond turtle protein

     由图4可以看出，在前4 h内，酶解度较低，4 h-6 h之间酶解度迅速升高，并在6 h时达到最大，在6 h-7 h之间水解度有所降低，但在7 h后又有升高趋势，但趋势不明显，考虑到酶解时间太长对酶活可能会有一定的影响，因此根据酶解的实验结果选用6 h为最佳酶解时间。

3.7 料液比对水解度的影响

图5 料液比对水解度的影响

Fig.5 Effect of the YPT extract to water on the hydrolysis of yellow pond turtle protein

     由图5可以看出，在料液比为1:30时，碱性蛋白酶对石金钱龟提取物的水解度最高。其原因可能是料液比较小时，底物浓度过高，分散不均匀，过多底物分子堆集于酶的活动中心，从而会影响酶催化速度及产物分子的扩散，故水解度较低；液固比过大的话，一方面虽然使底物分散更均匀，溶解度增加，但同时酶的浓度下降，势必对蛋白水解造成不利影响。

3.8 酶量对水解度的影响

图6 酶量对水解度的影响

Fig.6 Effect of enzyme content on the hydrolysis of yellow pond turtle protein

      由图6可以看出，随着酶量的增加，水解度也随着增加，但当酶量达到3%以后，水解度增加不明显，趋于平衡，为了考虑经济效益，因为选用3%的酶量为酶解的最佳酶量。

3.9 酶解pH值对水解度的影响

图7 pH值对水解度的影响

Fig.7 Effect of pH on the hydrolysis of yellow pond turtle protein

     由图7可以看出，在pH值为7.5时水解度最高，因此选用pH 7.5为最佳的酶解pH。

3.10 酶解温度对水解度的影响

图8 酶解温度对水解度的影响

Fig.8 Effect of temperature on the hydrolysis of yellow pond turtle protein

     由图8可以看出，在45 ℃ - 55 ℃范围内，随着温度的升高，水解度也随着升高，但在55 ℃ - 65 ℃时，水解度反而有所降低，据此，选用55 ℃作为酶解的最佳温度。

3.11 优化碱性蛋白酶酶解的最佳条件

     根据单因素实验结果，对加酶量、酶解温度、pH、料液比4个主要因素，以水解度为指标，采用L９（3４）正交设计进行实验，对酶解石金钱龟提取物的条件进行了优化。实验安排见表6，实验结果见表7。

表 6 碱性蛋白酶的正交试验因素和水平

Table 6 Factors and level of orthogonal experiment

表7 碱性蛋白酶酶解条件正交试验结果

Table 7 Results of orthogonal experiment

      对正交试验的结果采用极差分析的方法比较各因素对试验结果的影响大小。根据表7中计算的极差的大小可以看出，各因素对水解度影响的主次顺序为：pH值＞料液比＞酶解温度＞酶用量，可知pH值对碱性蛋白酶酶解的影响最大，而酶量对水解度的影响则较小。并可得出最适水解条件为A2B2C3D1，即pH值为7.5，水解温度为55 ℃，加酶量为3.5%，料液比为1∶25（g : ml），其水解度可达38.45%.

4 讨论

      通过本实验研究，表明石金钱龟提取物对免疫低下小鼠具有良好的恢复其免疫功能的作用；通过测定石金钱龟提取物中的主要活性成分，发现其蛋白质含量很高，高达56.97±1.01 (g/100g)，我们推断在提取物中起主要活性作用的组分可能为蛋白质，因此对提取物进行进一步的酶解，期望得到具有生物活性的肽类物质，根据本实验得到的最佳水解用酶为碱性蛋白酶，最佳酶解工艺为pH值为7.5，水解温度为55 ℃，加酶量为3.5%，料液比为1∶25（g:ml），酶解时间6 h，后期进一步对酶解得到的产物进行分析，以此来评价蛋白质、肽、氨基酸等在增强免疫方面所起到的重要作用。

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